teknikker , der anvendes til elektroforese

Gel elektroforese er en metode til at separere og identificere proteiner eller nukleinsyrer ( dvs. DNA og RNA ) baseret på deres størrelse og ladning. Lastning proteiner eller nukleinsyrer i boringer i en slab af polyacrylamid eller agarose gel , og derefter anvende et elektrisk felt , forårsager disse molekyler til vandrer gennem gelen , mindre eller mere stærkt ladede molekyler vil flytte hurtigere .

SDS-PAGE

SDS-PAGE er en fælles gelelektroforese teknik til adskillelse af proteiner ved hjælp af molekylær masse. Det indebærer forbehandling proteiner med et vaskemiddel kaldet natriumdodecylsulfat ( SDS ), der denaturerer dem ( dvs. får dem til at miste deres struktur ) . Mercaptoethanol er en anden almindelig forbehandlingen , og det ødelægger enhver disulfid obligationer bedrift protein subunits sammen .



Efter forbehandling , tilføjer forskerne de proteiner til polyacrylamid gel plade og anvende et elektrisk felt . Fordi negativt ladede SDS danner et kompleks med protein molekyler , vil de vandre mod den positive terminal . Større molekyler migrere langsommere , så denne proces adskiller proteiner på grundlag af massen .

isoelektrisk fokusering

Isoelektrisk fokusering baseret på forskelle i isoelektriske punkt , eller pH , hvor en protein har nogen omkostning , at adskille proteiner . Behandling af en smal tube polyacrylamid gel med særlige buffere skaber en pH gradient , således at den ene ende af røret er på et højt pH , og den anden er på et lavt pH .



Når udsættes for et elektrisk felt , hvert protein i prøven vandrer gennem gelen , indtil den når en pH , hvor det ikke har nogen omkostning , på dette punkt, elektrisk felt kan ikke køre det videre . Da proteiner har forskellige isoelektriske punkter , isoelektrisk fokusering er en effektiv måde at adskille proteiner .

2- D PAGE

2- D PAGE elektroforese er en kombination af SDS-PAGE og isoelektrisk fokusering . Den første fase omfatter udskille proteiner gennem isoelektrisk fokusering , den anden ved at placere gel fra isoelektrisk fokusering scenen på toppen endnu slab af gel , behandle proteiner med SDS , og anvender et elektrisk felt .



Således 2- D PAGE skiller proteiner ved både isoelektrisk punkt og molekylmasse at danne en 2- D " kort "af proteiner i prøven .

Agarosegelelektroforese

Forskere normalt hver DNA- fragmenter ved hjælp af agarose gel i stedet for polyacrylamid gel . Agarose er en stivelsesholdige pulver udvundet af tang . Blande det med en buffer og opvarmes i en mikrobølgeovn skaber en tyk gel , der størkner , da det køler , en prøve kam og derefter skaber " boringer "i gel , som holder protein prøver .



agarosegel elektroforese er almindelig i DNA fingeraftryk , og også i begrænsningen-polymorfisme ( RFLP ) afprøvning , sidstnævnte er en ældre teknik, der indebærer at skære DNA i småstykker ved hjælp af restriktionsenzymer ( enzymer , der gør nedskæringer på bestemte sekvenser ) , og adskiller dem på grundlag af deres størrelse .

DNA-sekventering

De fleste metoder til DNA- sekventering inddrage polyacrylamid gel elektroforese . I denne proces , inkuber forskere flere kopier af et enkelt DNA -skabelon med nukleotider ( byggestenene til syntese DNA ) og DNA- polymerase (et enzym , der replikerer DNA ) .



Når visse Kemisk modificeret nukleotider bindes til udgangen af en voksende kæde af DNA nukleotider , de opsige denne kæde ; disse særlige kæde-afslutning nukleotider kaldes dideoxynucleotides . Der er fire slags dideoxynucleotides , som hver især bærer forskellige farve fluorescerende farvestof .



Da DNA polymeraser lave kopier af en enkelt DNA -skabelon , de lejlighedsvis indsæt en dideoxynucleotide i stedet for en almindelig nukleotid . Da dette sker på forskellige steder for forskellige kopier af skabelonen , den resulterende blanding indeholder delvise kopier af de originale , der slutter med forskellige steder , og derfor har forskellige længder .



Næste , polyacrylamid gel elektroforese adskiller fragmenter på grundlag af størrelse , og en særlig detektor identificerer den fluorescerende farvestof på dideoxynucleotide i slutningen af hver kæde . Den rækkefølge , som disse farvestoffer forekommer afslører rækkefølgen af nukleotider i den oprindelige DNA skabelon , og dermed den oprindelige DNA- sekvensen .

1470248530.pdf 1480249014.pdf


Kommentarer

Vi ønsker, at dine argumenter og meninger er velkomne. Være objektiv og medfølelse. Mange mennesker læser hvad du skriver. Gør debat til en bedre oplevelse for både dem og dig selv. Mellem 20:00 og 08:00 det er lukket for kommentering og vi fjerner automatisk kommentarer med sjofle ord, defineret af vores moderatorer.

link:

  • Om os
  • Advertising
  • Fortæl redaktionen
  • Få nyhedsbreve
  • RSS-feed

Redaktør: Karin Christofferse
Nyheder redactor: Morten Nyberg

Kundeservice: Stig Ole Salomon,
Flemming Sørensen

Tel: +45 00 99 99 00
Fax: +45 00 99 99 01

© Copyright 2014 Einsten.net - All rights reserved.