de tre trin i PCR

Polymerase kædereaktion ( PCR ) er en kraftfuld teknik, der forstærker gener eller nogen fragment af DNA , hvilket gør millioner af DNA kopier fra et molekyle . Reaktionen består af tre trin : denaturering , udglødning og udvidelse . Et PCR er sat op i vand , som indeholder en buffer for at holde pH konstant . Det kræver også af deoxynukleotider ( også kaldet dNTPs ) . Disse er de fire byggesten DNA . Kary Mullis modtog Nobelprisen i kemi i 1993 for at udvikle PCR

Anskaf en prøve

Til at begynde , skal du få en prøve ( og rækkefølgen ) i DNA , du ønsker at uddybe . Dette varierer meget afhængigt af den kilde af DNA . Oprindelsen af DNA-prøven kunne kliniske prøver , planter , bakterier , kadavere eller knogler . Heldigvis er der kommercielt tilgængelige kits til at udtrække DNA fra specifikke typer af prøver .

Denaturering

DNA er en dobbelt-strenget molekyle ( to strenge, der supplerer hinanden ) . At foretage en PCR , DNA strenge skal adskilles . Ved opvarmning i stikprøven, vil trådene separat ( denne proces kaldes denaturering ) . Det første trin i en PCR er at opvarme prøven til 95 grader Celsius . Når DNA er tilgængelig som en enkelt -strenget molekyle , følgende skridt er muligt .

Hydraulik

Det andet trin består af afkølingen (der er dobbelt DNA-strenge ) mellem korte stykker DNA kaldet primere , der vil anerkende et bestemt region , der har været målrettet til forstærkning . De fleste almindelige programmer kræver to primere : en anneals til bunden streng af DNA og de andre anneals til toppen Strand . Du ønsker at have disse placeret primere , så dit mål sekvens er mellem enderne af dem .

primere skal udformes og forberedes specielt til netop din eksperiment .

Grundere er forholdsvis korte tråde af enkelte DNA , også kaldet oligonucleotider . Flere selskaber kan syntetisere disse til relativt lave priser . Integreret DNA teknologi ( IDT ) ( idtdna. com ) er en af de primære virksomheder i USA , der leverer denne tjeneste .

Normalt selskaber , der leverer disse tjenester har en software ( og tutorials til hvordan man bruge dem ) for primer design . Du skal bruge en sekvens af DNA , du forsøger at forstærke .

Din primere ville være normalt mellem 18 til 30 nukleotider lang. Deres smeltetemperatur mellem 55 til 65 grader Celsius ( dette er den anden temperatur ) . Det er vigtigt, at smeltepunktet for hver af dine primere er tæt . Den software , der er nævnt ovenfor letter denne opgave . Når du har din primere , skal du programmet i thermocycler , en maskine, der ændrer temperaturen i cykler . Normalt denne anden temperatur holdes i cirka 30 sekunder.

Udvidelse

Når primere er i deres position , Taq polymerase, det enzym, som kopierer skabelonen DNA , kommer ind i billedet . Dette enzym er fremstillet af en organisme ( Thermus aquaticus ) , der lever ved høje temperaturer ( 70 grader celsius) i varme kilder , så det er enzymer er aktive ved høje temperaturer . Temperaturen bruges til eksperimenter er omkring 72 grader Celsius . Den tid der kræves til dette trin afhænger af størrelsen af DNA , der skal forstærkes . Normalt et minut tilladt for hvor 1. 000 baser af DNA , der skal kopieres .

Taq polymerase skaber nye strenge af DNA ved incorpoating den nukleotider ( indført i reaktionsblandingen sammen med de andre forsyninger ) modsat en af de strenge , der fungerer som en skabelon .

Cycles af forstærkning

Denaturering er udglødning og udvidelse gentaget omkring 20 gange . Hver cyklus gør en kopi af din målsekvens , og antallet af kopier stiger eksponentielt , og nåede 1024 eksemplarer på kun 10 cykler .


Kommentarer

Vi ønsker, at dine argumenter og meninger er velkomne. Være objektiv og medfølelse. Mange mennesker læser hvad du skriver. Gør debat til en bedre oplevelse for både dem og dig selv. Mellem 20:00 og 08:00 det er lukket for kommentering og vi fjerner automatisk kommentarer med sjofle ord, defineret af vores moderatorer.

link:

  • Om os
  • Advertising
  • Fortæl redaktionen
  • Få nyhedsbreve
  • RSS-feed

Redaktør: Karin Christofferse
Nyheder redactor: Morten Nyberg

Kundeservice: Stig Ole Salomon,
Flemming Sørensen

Tel: +45 00 99 99 00
Fax: +45 00 99 99 01

© Copyright 2014 Einsten.net - All rights reserved.